El glifosato es uno de los herbicidas más utilizados a nivel mundial y aunque sus efectos sobre la comunidad microbiana han sido estudiados extensivamente, poco se conoce sobre sus efectos en el ciclo de nutrientes (C, N y P), y la actividad de las exo-enzimas microbianas. En este trabajo, el objetivo fue evaluar estos aspectos, separando entre un suelo con uso de glifosato, una parcela de nopal (PN) y una parcela abandonada sin uso previo de glifosato (PA). Se probaron los efectos del glifosato puro y de una formulación comercial del herbicida (FCH) sobre la actividad microbiana realizando una incubación de suelo, donde se midió periódicamente la respiración microbiana (CO2). Después de la incubación se midieron nutrientes orgánicos disueltos, P y N inorgánicos disponibles, C y P inmovilizados en microorganismos (Cmic, Pmic) y actividad enzimática de B-glucosidasa, N-acetil glucosaminidasa, fosfomonoesterasa, fosfodiesterasa, fosfonatasa y lacasa. Los efectos de la comunidad microbiana del suelo se probaron con un perfil de ácidos grasos y la degradación de glifosato y FCH se probó utilizando cultivos bacterianos de las muestras provenientes de la incubación en un medio definido con fosfato de potasio, glifosato o FCH como única fuente de P. Nuestros resultados sugieren que tanto el glifosato puro como la FCH, afectaron la actividad microbiana del suelo sin historial de uso del herbicida (PA), pues la tasa de mineralización se redujo significativamente en estas muestras con ambos tratamientos, en comparación con el control. Un análisis de regresión múltiple mostró que en el suelo del sitio PA, la respiración fue explicada por la actividad enzimática específica, los cocientes de nutrientes orgánicos disueltos y la relación Cmic/Pmic. Además, la aplicación de FCH redujo el contenido de Pmic y la actividad de lacasa en el suelo proveniente de PA pero incrementó la actividad específica de fosfonatasa y fosfodiesterasa. La comunidad microbiana en el suelo PN reveló un índice de diversidad mayor que el suelo PA, pero solo se mostraron cambios en los grupos microbianos de ácidos grasos cuando se aplicó FCH. Los aislados bacterianos fueron susceptibles a la FCH tanto en suelos de PN como de PA. Nuestros resultados demostraron cambios en algunos procesos relacionados con los ciclos de C y P cuando se aplicaron glifosato puro y la FCH, junto con cambios en la actividad microbiana y la estructura de la comunidad, siendo más fuertes los efectos con la formulación comercial utilizada.